Débora Torrealba ● Profesora Asistente

Producción Escalable de Inmunoestimulantes Nanoestructurados para el Control de Piscirickettsiosis en Salmón del Atlántico

Tenacibaculosis is an emerging pathogen recently classified as high-risk disease. Since 2020 it is the second pathogen after Piscirickettsia salmonis producing higher mortalities in Atlantic salmon. Diverses species of Tenacibaculosis has been described in Chile, but Tenacibaculum dicentrarchi present the higher prevalence in culture centers. Before 2018, underreporting of Tenacibaculosis was possible due to the external signology is similar with Piscirickettsiosis. P. salmonis is the main pathogen in Chilean salmon farming, causing the principals mortalities because of diseases. In recent years, concerns related to Tenacibaculosis and Piscirickettsiosis coinfection have increased due to detrimental effects on the health status of fish in comparison to the single infection. Our proposal aim to characterize the immune response elicit by T. dicentrarchi in Atlantic salmon and describe how it is related to a coinfection by P. salmonis. First, we propose the description of the single infection of T. dicentrarchi due to the lack of information about the immune response it induces in Atlantic salmon. Then, we propose the characterization of the coinfection between T. dicentrarchi and P. salmonis and the possible weaker of the health status of the fish due to T. dicentrarchi may favors the development of the secondary infection. Therefore, we hypothesize that “Tenacibaculum dicentrarchi chronic infection triggers a type 2 immunity (Th2/M2) IL-4/13/ IL-10+ phenotype in head kidney and spleen of Atlantic salmon, increasing the secretion of anti-inflammatory cytokine IL-10, which favor and increase the severity of Piscirickettsia salmonis coinfection”. The general objective of the proposal is to demonstrate that a chronic infection of Tenacibaculum dicentrarchi causes in Atlantic salmon a status of head kidney and spleen immunosuppression presented an IL 4/13/ IL-10+ phenotype and increasing the mortality provoked by Piscirickettsia salmonis coinfection. To demonstrate the hypothesis, three specific objectives are proposed. First specific objective is “Characterize the immunological response of the single infection of T. dicentrarchi and coinfection with T. dicentrarchi and P. salmonis in Atlantic salmon under field conditions during outbreak seasons”. For this specific objective, we designed the Trial 1: Field sampling in open-sea cages during a single infection of T. dicentrarchi in winter and a coinfection with T. dicentrarchi and P. salmonis in spring. The analysis of the immune response will be through gene expression by RT-PCR and proteins by ELISA and western blotting. Then, the second objective propose is “Verify the type 2 immunity (Th2/M2) IL-4/13/ IL-10+ phenotype elicit by a T. dicentrarchi infection in Atlantic salmon under controlled conditions of laboratory”. To accomplish this goal we designed the Trial 2: A single infection challenge with T. dicentrarchi in Atlantic salmon in laboratory conditions in order to better characterize the immune response at a cellular level by flow cytometry and a molecular level by RNA-seq, RT-PCR and protein level. The final specific objective is “Characterize at the immunological level the development and severity of P. salmonis infection in Atlantic salmon infected by T. dicentrarchi under controlled conditions of laboratory”. To achieve this objective we designed the Trial 3: A coinfection with T. dicentrarchi and P. salmonis in Atlantic salmon in laboratory conditions with the respective single infection controls of each pathogen and posterior analysis by molecular and protein level. The expected results are: 1) The characterization of the immune response at functional level of the single infection of T. dicentrarchi and the coinfection of T. dicentrarchi and P. salmonis in Atlantic salmon in open-sea cages; 2) Verification that T. dicentrarchi triggers a type 2 immunity (Th2/M2) with an increase in the secretion of cytokine IL-10 demonstrated through transcript, protein, and cellular analysis in laboratory conditions that will let us a better resolution of the immune response characterization in comparison with the field conditions; 3) Characterization of the development of a more harmful P. salmonis infection due to the weaker health status on Atlantic salmon produced by of T. dicentrarchi, which means a higher bacterial load of P. salmonis and mortality rate in coinfected fish with T. dicentrarchi and P. salmonis. The results obtained in this research will provide animal health information to improve the productive management of salmonids and contribute to the knowledge of the health status of Atlantic salmon in the context of the two main pathogens affecting Chilean aquaculture nowadays.

Síntesis y caracterización de sistemas de liberación basados en quitosano y estudio de efectos inmunomoduladores en peces de acuicultura (Chitfish)

Piscirickettsia salmonis una de las enfermedades más graves y perjudiciales que afecta a la industria salmonera en Chile, provocando altas mortalidades con pérdidas económicas de USD 700 al año. Esta bacteria intracelular produce la Piscirickettsiosis enfermedad tratada principalmente con vacunas y antibióticos. Sin embargo, y a pesar de existir 34 vacunas comerciales disponibles, estas no han demostrado controlar totalmente los brotes epidémicos. Por otro lado, los antibióticos logran controlar la enfermedad, pero disminuyen el valor del producto debido a la connotación negativa por el riesgo a la salud tanto de animales como humanos. En base a esta problemática es que surge la necesidad de desarrollar nuevos métodos profilácticos que contribuyan al control de este patógeno que pone en riesgo la sustentabilidad de la industria salmonera en Chile. Un nuevo método profiláctico son las nanoproteínas quiméricas, agregados de proteínas que son liberadas gradualmente en el tiempo aumentando su efecto protector, no necesitan de encapsulación, su producción es escalable en biorreactores, son liofilizables, y son altamente estables a condiciones adveras de temperatura y pH. En mi tesis de doctorado en conjunto con la empresa Nanoprot proponemos el desarrollo y producción de un prototipo de baja resolución de una vacuna en base a nanoproteínas quiméricas para combatir brotes de P. salmonis. Nuestro primer objetivo es desarrollar nanoproteínas en base a proteínas formadas por regiones altamente inmunogénicas y antigénicas de distintas secuencias aminoacídicas de P. salmonis. Su conformación proteica en conjunto con una lenta liberación en el tiempo permitirá aumentar la protección en salmónidos frente a esta bacteria, sin necesidad de vacunación de refuerzo. Luego del diseño, se seleccionará la nanoproteína quimérica que cumpla con las características de eficiencia de producción, funcionalidad y capacidad de modular la respuesta inmune en base a ensayos in vitro en macrófagos de salmón del Atlántico. Finalmente, se evaluará en bioensayo si generan una respuesta inmune adaptativo-prolongada en el tiempo en salmón del Atlántico. Los resultados obtenidos serán: (1) prototipo de baja resolución de una vacuna; (2) Know-how relativo a la formulación del producto; (3) estudio de patentabilidad y/o licenciamiento del prototipo; (4) publicación de artículo científico y difusión; (5) levantamiento de recursos para continuidad de proyecto; y (6) entrega de tesis y prototipo a empresa. El proyecto de tesis es parte de las líneas de desarrollo de Nanoprot; se enmarcan en las necesidades de la empresa del desarrollo de investigación de I+D+i que permita brindar una solución innovadora para el control de la Piscirickettiosis. Nanoprot es una start-up que nace en la PUCV, por lo que existe una estrecha vinculación entre el tesista, tutor y el mentor en el desarrollo de la propuesta. La creación de este prototipo nos brindará la oportunidad de postular a nuevos fondos que den continuidad a este trabajo y que permitan mi contratación por parte de la empresa. Asimismo, aportará una solución innovadora a la industria salmonera disminuyendo las mortalidades, pérdidas económicas y uso de antibióticos asociadas a P. salmonis.

La Piscirickettsiosis es una grave enfermedad bacteriana que resulta en altos niveles de mortalidad en diferentes especies de salmónidos. Las pérdidas totales, incluidos los costos de vacunación y los tratamientos antimicrobianos se han estimado en alrededor de $ 450 millones de dólares por año en Chile. Desafortunadamente, las vacunas contra este patógeno han mostrado ser poco efectivas para prevenir esta enfermedad, lo que se ha asociado a fenómenos de coinfección de Caligus, variabilidad del patógeno y del hospedero. Recientes estudios muestran, además, que los mecanismos de respuesta inmune innata son los responsables de otorgar protección a los peces frente a un desafío con esta bacteria. De esta manera, la falta de tratamientos eficaces contra Piscirickettsia salmonis fundamentan la necesidad de buscar nuevas alternativas de tratamientos profilácticos, las que deberían estar orientados a reforzar el sistema inmune innato del hospedador. En base a estas necesidades nosotros proponemos evaluar proteínas nanoestructuradas, también conocidas como cuerpos de inclusión como inmunoestimulantes para el control de P. salmonis en salmón del Atlántico (Salmo salar). Estas proteínas nanoestructuradas pueden expresar cualquier proteína con una función de interés, la cual es liberada gradualmente en el tiempo. Además, son muy estables y resisten duras condiciones fisicoquímicas manteniendo su funcionalidad por lo que no es necesario su encapsulación. Debido a que la producción de estas proteínas es altamente escalable en biorreactores bacterianos surgen entonces como una herramienta de biotecnología viable de llegar a ser una solución comercial. Recientemente he evaluado con éxito el uso de proteínas nanoestructuradas de citoquinas como inmunoestimulantes en trucha arcoíris (Onchorhynchuss mykiss) y el pez cebra (Danio rerio). La prueba de concepto de esta tecnología mostró que los cuerpos de inclusión pueden estimular una respuesta inmune en macrófagos de trucha arcoíris. Además, las proteínas nanoestructuradas administrados por vía intraperitoneal protegen al pez cebra frente a una infección bacteriana letal y al ser administrados oralmente son absorbidos por células presentes en la mucosa intestinal. En base a esto, proponemos como proyecto desarrollar proteínas nanoestructuradas como inmunoestimulantes contra Piscirickettsia, para ello contaremos con la asesoría técnica de tres laboratorios de la PUCV. Como primer objetivo realizaremos la clonación de los genes que expresan las proteínas de interés y la producción de los plásmidos para ser expresados en bacterias. Este objetivo se llevará a cabo en el Laboratorio de Genética y Genómica Aplicada. En el segundo objetivo, produciremos las proteínas recombinantes con la asesoría técnica y en las instalaciones del Laboratorio de Cultivo de Células Microbianas. Este grupo es experto en la producción de proteínas recombinantes en biorreactores de bacterias. Como tercer objetivo cuantificaremos y caracterizaremos las proteínas producidas con la asesoría y en el laboratorio del Grupo de Marcadores Inmunológicos de Organismos Acuáticos. Este laboratorio es especialista en la purificación, cuantificación y caracterización de proteínas. Además, contaremos con la asesoría del Laboratorio de Genética y Genómica Aplicada en cuanto a cómo dar continuidad al presente proyecto e introducir el producto en la industria. Nosotros esperamos como resultado de este proyecto desarrollar proteínas nanoestructuradas que sean administradas a peces como inmunoestimulantes contra Piscirickettsia. El desarrollo de un método profiláctico efectivo contra P. salmonis permitirá disminuir las pérdidas económicas asociadas a la Piscirickettsiosis y disminuir el uso excesivo de antibióticos en la industria de cultivo de salmones en Chile.

La Piscirickettsiosis es una grave enfermedad bacteriana que resulta en altos niveles de mortalidad en diferentes especies de salmónidos. Las pérdidas totales, incluidos los costos de vacunación y los tratamientos antimicrobianos se han estimado en alrededor de $ 450 millones de dólares por año. Desafortunadamente, las vacunas contra este patógeno han mostrado ser poco efectivas para prevenir esta enfermedad, lo que se ha asociado según estudios de nuestro laboratorio a fenómenos de coinfección de Caligus, variabilidad del patógeno y del hospedero. Recientes estudios muestran, además, que los mecanismos de respuesta inmune innata son los responsables de otorgar protección a los peces frente a un desafío con esta bacteria. De esta manera, la falta de tratamientos eficaces contra Piscirickettsia salmonis fundamentan la necesidad de buscar nuevas alternativas de tratamientos profilácticos, las que deberían estar orientados a reforzar el sistema inmune innato del hospedador. En base a estas necesidades nosotros proponemos evaluar cuerpos de inclusión como inmunoestimulantes de administración oral para el control de P. salmonis en salmón del Atlántico (Salmo salar). Los cuerpos de inclusión son agregados de proteínas recombinantes nanoestructuradas funcionales expresados usualmente en el citoplasma de bacterias recombinantes. Los cuerpos de inclusión pueden expresar cualquier proteína con una función de interés, la cual es liberada gradualmente en el tiempo. Además, son muy estables y resisten duras condiciones fisicoquímicas manteniendo su funcionalidad por lo que no es necesario su encapsulación. Debido a que la producción de los cuerpos de inclusión es altamente escalable en biorreactores bacterianos surgen entonces como una herramienta de biotecnología susceptible de llegar a ser una solución comercial. Recientemente he evaluado con éxito el uso de cuerpos de inclusión de citoquinas como inmunoestimulantes en trucha arcoíris (Onchorhynchuss mykiss) y el pez cebra (Danio rerio). La prueba de concepto de esta tecnología mostró que los cuerpos de inclusión pueden estimular una respuesta inmune en macrófagos de trucha arcoíris. Además, los cuerpos de inclusión administrados por vía intraperitoneal protegen al pez cebra frente a una infección bacteriana letal y al ser administrados oralmente son absorbidos por células presentes en la mucosa intestinal. Postulamos como hipótesis que los cuerpos de inclusión administrados por vía oral otorgan protección al salmón del atlántico contra P. salmonis. Como primer objetivo de este estudio proponemos realizar la producción y caracterización de los cuerpos de inclusión de dos proteínas relacionadas al sistema inmune innato de salmón del Atlántico. En el segundo objetivo, evaluaremos la capacidad de inmunomodulación del sistema inmune por parte de los cuerpos de inclusión al ser administrados en diferentes dosis a través de la intubación de los peces. Para ello usaremos RT-qPCR donde analizaremos la capacidad moduladora de los cuerpos de inclusión a través de la expresión génica de citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-1β, IFNγ), antiinflamatorias (IL-10), enzima proinflamatoria (COX-2), y receptor tipo Toll (TLR9). También analizaremos TNFα e IL-10 a través de ELISA. Igualmente, se analizará si los cuerpos de inclusión marcados con un fluoróforo son endocitados por células intestinales y si son trasladados al bazo a través de citometría de flujo. En el tercer objetivo, analizaremos la eficacia de los cuerpos de inclusión para el control de P. salmonis en salmón del Atlántico administrados a través del alimento en un desafío experimental. Se evaluará a través de técnicas moleculares (RT-qPCR y ELISA) citoquinas proinflamatorias, antiinflamatorias, enzima proinflamatoria, y receptor tipo Toll para analizar la capacidad inmunomoduladora de los cuerpos de inclusión durante un desafío bacteriano. Asimismo, evaluaremos sobrevivencia, carga de P. salmonis y necropsia de los tejidos. Nosotros esperamos como resultado de esta investigación que los cuerpos de inclusión aumenten la sobrevivencia de salmón del Atlántico frente a un desafío de P. salmonis. El desarrollo de un método profiláctico efectivo contra P. salmonis permitirá disminuir las pérdidas económicas asociadas a la Piscirickettsiosis y disminuir el uso excesivo de antibióticos en la industria de cultivo de salmones en Chile.