Proyectos

Compelling evidence shows that adverse intrauterine conditions increase the risk to develop cardiometabolic diseases in the adulthood. This concept has been called ‘Developmental Origins of Health and Disease’ (DOHaD) and relies on the activation of mechanisms sensing and signaling a diversity of stimuli during early development that later lead to higher risk of disease. The mechanisms that have been broadly suggested to be involved in these processes are epigenetic modifications in key gene promoters that could ‘record’ normal and abnormal perinatal stimuli. Intrauterine oxidative stress is a common feature in conditions with altered fetal growth (i.e. intrauterine growth restriction –IUGR-, or macrosomia). Several cellular processes require the participation of pro-oxidant molecules which are normally neutralized by antioxidant defenses. However, under determined conditions the pro-oxidants overcome these defenses inducing oxidative stress. The latter is an important stimulus that regulates vascular function and cardiovascular physiology, playing a key role in the development of cardiovascular diseases, regulating negatively the bioavailability of the main vasodilator nitric oxide (NO). In addition, the vascular system presents a high phenotypic plasticity during life, which is modulated and restricted by epigenetic mechanisms (including DNA methylation, histone post-translational modifications and micro RNAs). Interestingly, cultured placental endothelium derived from complicated pregnancies presents persistent abnormal phenotypes, characterized by altered expression of proteins involved in NO-dependent vasodilation (i.e. eNOS and arginase), suggesting an early onset of endothelial dysfunction. Preliminary data from in vitro experiments, show that this altered expression of eNOS in IUGR placenta-derived endothelial cells is accompanied by epigenetic alterations in the promoter of its gene. Moreover, these cells can be reprogrammed to a “normal type”, interfering with the molecular machinery that preserves the DNA methylation pattern. However, there are no studies addressing the role of the pro-oxidant status associated to IUGR on the epigenetic programming of placental vascular dysfunction, and whether these epigenetic changes reflect those present in other fetal vascular beds or in the adult cardiovascular system. Therefore, we hypothesized that the in utero oxidative stress, that characterizes IUGR, induces an epigenetic programming of the endothelial function, which is linked to abnormal umbilical and fetal vascular reactivity and higher risk of adult cardiovascular disease. These epigenetic changes lead to an altered expression of endothelial function-related proteins and to their response to superimposed oxidative stress in umbilical and systemic arteries in the fetus and adult guinea pig. If true, the development of IUGR in the presence of antioxidant treatment should prevent the vascular impairment in the fetus and the adult guinea pig. This hypothesis will be tested in an IUGR guinea pig model according to the following general aims (GA): GA-1. To determine whether the IUGR-associated oxidative stress induces endothelial dysfunction in umbilical and systemic arteries, altering the basal expression of proteins implicated in the NO-dependent vasodilation (NO-DV) pathway and their response to oxidative stress; GA-2. To determine in umbilical artery (UAEC) and aortic (AEC) endothelial cells whether endothelial dysfunction induced by fetal oxidative stress associates with epigenetic changes in the promoter of genes implicated in the NO-DV pathway, altering their response to oxidative stress in vitro; GA-3. To determine in adult life whether the IUGR-associated oxidative stress results in increased markers of endothelial dysfunction, oxidative stress and cardiovascular disease. GA-4. To determine in AEC of adults born with IUGR whether endothelial dysfunction induced by fetal oxidative stress is associated with epigenetic changes in the promoter of genes implicated in the NO-DV pathway and their response to oxidative stress in vitro, correlating them with those found at term of gestation. IUGR will be induced by uterine artery ligation in a pregnant sow, and the role of oxidative stress in the vascular programming will be analyzed treating IUGR pregnancies with the antioxidant N-acetylcysteine. The acute effect of pro- and anti-oxidants on vascular reactivity and NO-dependent vasodilation will be determined by wire-myography in IUGR near-term fetuses and adults guinea pig arteries. Further, the presence of proteins related with NO-dependent vasodilation (eNOS, arginase, HO-1, NQO1 and DHFR) in these vessels will be determined by immunohistochemistry. Endothelial epigenetic programming will be analyzed in primary cell cultures from UAEC and AEC in near-term fetuses and AEC in adult guinea pigs. Our expected outcome is to demonstrate that oxidative stress is one of the main sources of the IUGR-induced dysfunction in fetal and adult vascular beds. Further, we expect that the NAC treatment should be able to prevent partially or totally the programmed vascular impairment. This project is not only relevant to uncover the developmental mechanisms that determine short- and long-term vascular dysfunction, but also to propose eventual treatments in complicated pregnancies, that unfortunately present a very high rate in humans.

Hay pruebas sólidas de que tanto la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) y la macrosomía fetal (peso al nacer > 4000 g) están fuertemente asociados con el aumento del riesgo de enfermedades crónicas en la vida adulta (i.e. hipertensión arterial y diabetes tipo 2). La asociación entre el desarrollo peri-concepcional y fetal con la salud en la vida adulta, llamada “Programación Fetal” se basa en la activación de mecanismos de detección y señalización de una diversidad de estímulos durante el desarrollo temprano. Los mecanismos que han sido ampliamente sugerido que participan en estos procesos son las modificaciones epigenéticas que podrían registrar los estímulos perinatales. Como testigo de los cambios perinatales a los que se ve expuesto el embrión y luego el feto en su desarrollo y crecimiento está la placenta, que junto con estar constituida por tejido que regula el intercambio de nutrientes y la modulación inmune está formada por una importante red vascular que permite obtener desde la sangre materna los nutrientes, el oxígeno, las señales hormonales y del sistema inmune. El sistema vascular de la placenta se proyecta igualmente en la circulación sistémica del feto, donde se sugiere que ocurren adaptaciones en las condiciones patológicas antes mencionadas (RCIU y macrosomía fetal secundaria a obesidad materna), condicionando así a estos niños a presentar un elevado riesgo de enfermedades cardiometabólicas en la vida adulta. Este proyecto propuso estudiar la presencia de marcas epigenéticas (cambios en el patrón de metilación de citosinas en la región promotora de genes y cambios en la modificación de histonas que participan en el estado de compactación/relajación de la cromatina) en las células vasculares de la arteria umbilical (HUAEC), cambios en la función vascular y expresión de genes, proteínas y actividad de enzimas claves en la función vascular en tres grupos de gestantes: 1) gestantes normopeso con fetos de crecimiento normal denominados “Adecuados para la Edad Gestacional” (AEG); 2) gestantes normopeso con fetos que presentaron Restricción del Crecimiento IntraUterino (RCIU) y 3) gestantes con obesidad pregestacional que tuvieron hijos que fueron Grandes para la Edad Gestacional (FMOM). Los objetivos y los resultados principales de este proyecto fueron: 1) Estudiar el tono vascular de las arterias umbilicales y coriónicas de la placenta en estas tres condiciones clínicas con acento en la participación de las vías dependiente de óxido nítrico, un vasodilatador dependiente del endotelio, clave en el tono vascular placentario. Se determinó que las arterias coriónicas y placentarias de los fetos RCIU y FMOM presentan disfunción vascular dependiente de óxido nítrico y que existe un desbalance entre la actividad de arginasa-2/eNOS que favorece esta disfunción. (ver Krause et al. Placenta 2012; 2013; Schneider et al., Placenta 2015). 2) Determinar si estos cambios en el tono vascular placentario y umbilical se correlacionan a cambios en la expresión de genes y proteínas claves en la función vascular (eNOS, Arg2, CAT-1) y de respuesta estrés oxidativo (NOX4, GPx-1, SOD-1 y HO-1) en los cultivos primarios de HUAEC de las tres condiciones clínicas, así como en los tejidos (cordones umbilicales y arterias coriónicas) (ver Schneider et al., Placenta 2015). Se determinó que estos vasos están marcados por una respuesta crónica a estrés oxidativo, presentando una limitada reserva vascular al estrés oxidativo, comparado con los tejidos provenientes de embarazos AEG (ver Schneider et al., Placenta 2015). 3) Estudiar la presencia de modificaciones epigenéticas presentes en la región promotora de los genes relacionados con la vía de síntesis del óxido nítrico (NO) y determinar si la respuesta al estrés oxidativo y/o hipoxia están programadas epigeneticamente. Se determinó que de todos los genes estudiados sólo eNOS y Arg2 presentan cambios en el patrón de metilación en la región promotora (ver Krause et al., Epigenetics 2013) que se correlacionan con las modificaciones de histonas encargadas de regular el estado de compactación de la cromatina (Caniuguir et al., en preparación). 4) Ahondar en la participación de los mecanismos epigenéticos (HDAC y DNMT) en la expresión basal de estos genes en las tres condiciones clínicas. Se determinó muy elegantemente como NO es quien regula a nivel epigenético la apertura de la cromatina de arginasa 2 y su actividad transcripcional (ver Krause et al., Biochem Pharmacol 2016). El desarrollo de este proyecto tuvo como fruto 18 artículos en revistas indexadas, la mitad de ellos directamente relacionados con resultados de este proyecto y los otros de colaboraciones nacidas durante estos años, que apuntan directamente a comprender los mecanismos que subyacen la programación fetal de enfermedades cardiometabólicas en tejido placentario, en niños pre-adolescentes, modelos animales de RCIU y obesidad materna, proyectos clínicos de seguimiento de niños, etc. Este proyecto aportó en forma sustantiva a la generación de nuevo conocimiento en relación a los mecanismos moleculares que subyacen a la programación vascular alterada en fetos con RCIU y FMOM, que están en mayor riesgo de desarrollar enfermedades vasculares en la vida postnatal, con la relevancia clínica de la potencial aplicación en la detección temprana de factores de riesgo cardiovascular en el nacimiento.

Hay pruebas sólidas de que tanto la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) y la macrosomía fetal (peso al nacer > 4000 g) están fuertemente asociados con el aumento del riesgo de enfermedades crónicas en la vida adulta (i.e. hipertensión arterial y diabetes tipo 2). La asociación entre el desarrollo peri-concepcional y fetal con la salud en la vida adulta, llamada “Programación Fetal” se basa en la activación de mecanismos de detección y señalización de una diversidad de estímulos durante el desarrollo temprano. Los mecanismos que han sido ampliamente sugerido que participan en estos procesos son las modificaciones epigenéticas que podrían registrar los estímulos perinatales. Como testigo de los cambios perinatales a los que se ve expuesto el embrión y luego el feto en su desarrollo y crecimiento está la placenta, que junto con estar constituida por tejido que regula el intercambio de nutrientes y la modulación inmune está formada por una importante red vascular que permite obtener desde la sangre materna los nutrientes, el oxígeno, las señales hormonales y del sistema inmune. El sistema vascular de la placenta se proyecta igualmente en la circulación sistémica del feto, donde se sugiere que ocurren adaptaciones en las condiciones patológicas antes mencionadas (RCIU y macrosomía fetal secundaria a obesidad materna), condicionando así a estos niños a presentar un elevado riesgo de enfermedades cardiometabólicas en la vida adulta. Este proyecto propuso estudiar la presencia de marcas epigenéticas (cambios en el patrón de metilación de citosinas en la región promotora de genes y cambios en la modificación de histonas que participan en el estado de compactación/relajación de la cromatina) en las células vasculares de la arteria umbilical (HUAEC), cambios en la función vascular y expresión de genes, proteínas y actividad de enzimas claves en la función vascular en tres grupos de gestantes: 1) gestantes normopeso con fetos de crecimiento normal denominados “Adecuados para la Edad Gestacional” (AEG); 2) gestantes normopeso con fetos que presentaron Restricción del Crecimiento IntraUterino (RCIU) y 3) gestantes con obesidad pregestacional que tuvieron hijos que fueron Grandes para la Edad Gestacional (FMOM). Los objetivos y los resultados principales de este proyecto fueron: 1) Estudiar el tono vascular de las arterias umbilicales y coriónicas de la placenta en estas tres condiciones clínicas con acento en la participación de las vías dependiente de óxido nítrico, un vasodilatador dependiente del endotelio, clave en el tono vascular placentario. Se determinó que las arterias coriónicas y placentarias de los fetos RCIU y FMOM presentan disfunción vascular dependiente de óxido nítrico y que existe un desbalance entre la actividad de arginasa-2/eNOS que favorece esta disfunción. (ver Krause et al. Placenta 2012; 2013; Schneider et al., Placenta 2015). 2) Determinar si estos cambios en el tono vascular placentario y umbilical se correlacionan a cambios en la expresión de genes y proteínas claves en la función vascular (eNOS, Arg2, CAT-1) y de respuesta estrés oxidativo (NOX4, GPx-1, SOD-1 y HO-1) en los cultivos primarios de HUAEC de las tres condiciones clínicas, así como en los tejidos (cordones umbilicales y arterias coriónicas) (ver Schneider et al., Placenta 2015). Se determinó que estos vasos están marcados por una respuesta crónica a estrés oxidativo, presentando una limitada reserva vascular al estrés oxidativo, comparado con los tejidos provenientes de embarazos AEG (ver Schneider et al., Placenta 2015). 3) Estudiar la presencia de modificaciones epigenéticas presentes en la región promotora de los genes relacionados con la vía de síntesis del óxido nítrico (NO) y determinar si la respuesta al estrés oxidativo y/o hipoxia están programadas epigeneticamente. Se determinó que de todos los genes estudiados sólo eNOS y Arg2 presentan cambios en el patrón de metilación en la región promotora (ver Krause et al., Epigenetics 2013) que se correlacionan con las modificaciones de histonas encargadas de regular el estado de compactación de la cromatina (Caniuguir et al., en preparación). 4) Ahondar en la participación de los mecanismos epigenéticos (HDAC y DNMT) en la expresión basal de estos genes en las tres condiciones clínicas. Se determinó muy elegantemente como NO es quien regula a nivel epigenético la apertura de la cromatina de arginasa 2 y su actividad transcripcional (ver Krause et al., Biochem Pharmacol 2016). El desarrollo de este proyecto tuvo como fruto 18 artículos en revistas indexadas, la mitad de ellos directamente relacionados con resultados de este proyecto y los otros de colaboraciones nacidas durante estos años, que apuntan directamente a comprender los mecanismos que subyacen la programación fetal de enfermedades cardiometabólicas en tejido placentario, en niños pre-adolescentes, modelos animales de RCIU y obesidad materna, proyectos clínicos de seguimiento de niños, etc. Este proyecto aportó en forma sustantiva a la generación de nuevo conocimiento en relación a los mecanismos moleculares que subyacen a la programación vascular alterada en fetos con RCIU y FMOM, que están en mayor riesgo de desarrollar enfermedades vasculares en la vida postnatal, con la relevancia clínica de la potencial aplicación en la detección temprana de factores de riesgo cardiovascular en el nacimiento.